1939年12月，在八路军对日伪军进行艰苦的反“扫荡”作战之际，国民党顽固派掀起第一次反共高潮，派兵首先进攻陕甘宁边区的八路军留守兵团，接着进攻晋西和晋西北、晋东南以及冀南等地的八路军和山西新军。八路军和山西新军遵循中共中央、中央军委确立的“人不犯我，我不犯人；人若犯我，我必犯人”和“有理、有利、有节”的反摩擦斗争原则，展开自卫反击，打退国民党顽军的进攻，保卫了抗日根据地，维护了抗日民族统一战线。此后，山西新军进行整编（仍保留晋绥军番号），加入八路军的战斗序列。
八路军在斗争中不断发展壮大，1939年总兵力达到27万余人。由于部队新成员骤增，军政素质亟待提高，八路军总部决定从2月开始，利用战斗间隙进行两期共8个月的整军，建立健全各项规章制度，加强纪律，增强团结，进行战术技术训练，提高战斗力。遵照中共中央和中央军委关于大量吸收知识分子和加强干部培养的指示，先后在各师、旅建立教导团、教导大队或随营学校，抗日军政大学大部陆续由延安迁至华北敌后，在山东、晋察冀、晋绥、太行、太岳等抗日根据地建立了分校。八路军后勤部除原有的供给部、卫生部外，又成立了财经部和军事工业部，负责筹措经费和组织领导武器弹药的维修和生产，各军区和师、旅也建立了财经和军工生产部门，并在流动修械所的基础上相继建立了兵工厂。
1940年2月，为统一太行山南部地区八路军和山西新军的指挥，成立八路军第2纵队。4月，第2纵队奉命东进，与冀鲁豫支队会合，成立冀鲁豫军区。5月，第2纵队主力奉命南下豫皖苏边区，7～8月与新四军第6支队编成八路军第4、第5纵队。尔后，第4纵队执行向西防御、坚持豫皖苏边区的抗战任务；第5纵队执行东进开辟淮海地区，并与渡江北上的新四军共同完成开辟苏北的战略任务。1941年1月皖南事变后，第4、第5纵队分别编为新四军第4、第3师。
1940年秋，八路军在粉碎日伪军对各抗日根据地春、夏季“扫荡”之后，8月20日至1941年1月，对日伪军发动了有105个团的兵力参加的百团大战。仅前3个半月就进行了1800余次战役战斗，共歼灭日伪军4万余人，提高了中国共产党和八路军的声望，鼓舞和坚定了全国人民夺取抗战胜利的信心。
1938年10月～1940年底，八路军共粉碎日伪军1000人至1万人的“扫荡”94次，1万～5万人的大“扫荡”10次，同时打退国民党顽固派第一次反共高潮。1940年11月，成立晋西北军区（贺龙兼任司令员，关向应兼任政治委员），统一指挥第120师部队和在晋西北的山西新军。此时八路军发展到40万余人，共辖6个战略单位（军区），8个二级军区，44个军分区，40个旅和相当于旅的纵队、支队，170多个团和相当于团的支队、总队。
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